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INHIBICIÓN DE ANTITRIPSINA EN LEGUMINOSAS: CARAOTA, QUINCONCHO, TAPIRAMA Y FRIJOL BAYO


Bracho Espinoza Héctor , Rivero Nileydi;  Romero Gregoria.  Universidad Nacional Experimental “Francisco de Miranda”. Coro- Falcón, Venezuela


RESUMEN

Las leguminosas han sido utilizadas por el hombre desde la antigüedad, formando parte de su dieta, principalmente debido a su alto contenido de proteínas, sin embargo, este alimento presenta gran cantidad de  sustancias antinutricionales que afectan el proceso metabólico y la biodisponibilidad de los nutrientes. La antitripsina es uno de estos factores antinutricionales presentes en las leguminosas, interfiere en la digestión y/o absorción de las proteínas, produciendo retraso en el crecimiento, bajo índice de eficiencia proteica y en algunos casos hipertrofia pancreática. Por tales motivos surgió la necesidad de evaluar el contenido de antitripsina en leguminosas de uso común en la región, Caraotas (Phaseolus vulgaris L), Quinchoncho (Cajanus cajan L), Tapirama (Phaseolus lunatus L) y Frijol bayo (Vigna unguiculata). Las unidades de tripsina inhibidas (UTI) se determinaron por el método de la hidrólisis de caseína, midiendo la diferencia de absorbancia en el espectrofotómetro a 365 nm. Los resultados obtenidos para las muestras crudas fueron los siguientes, para Phaseolus vulgaris  24.73 UTI, Phaseolus lunatus 13.24 UTI, Cajanus cajan 27.55 UTI y Vigna unguiculata 43.40 UTI; clasificándose de bajos a moderados comparados con la soya. Se aplicaron procesos físicos como remojo y cocción con el fin de evaluar la disminución de las unidades de tripsina inhibidas, obteniendo como resultado una disminución en promedio del 44 %  para el remojo y 87 % para la cocción.

INTRODUCCIÓN:

Las semillas de leguminosas son alimentos completos, contiene simultáneamente carbohidratos, proteínas, lípidos y algunos micronutrientes como vitaminas y minerales, disponibles para la alimentación directa o indirecta del hombre; razón por la cual durante muchos años han constituido la fuente principal para el suministro de energía y proteína dietaría humana, (Pérez et al., 2013). Especialmente las leguminosas presentan en su composición sustancias antinutricionales (Serratos et al., 2008, Belmar 2011).

Los factores antinutricionales (FAN), son compuestos químicos generados por las plantas, que influyen en la aceptabilidad animal, inhiben la digestión al afectar la actividad catalítica de algunas enzimas, producen efectos tóxicos, y pueden limitar la absorción de alimentos, ya que dificultan la asimilación de nutrientes como proteínas y minerales (León et al., 2011, Levi et al., 1985); desde el punto de vista bioquímico estos factores pueden llegar a ser tóxicos o causar efectos fisiológicos poco deseables como: flatulencia, distensión estomacal, afecciones pancreáticas, aglutinación de glóbulos rojos, disminución en la asimilación de nutrientes, entre otros( Benites et al., 2008, Elizalde et al., 2012).

 Los factores antinutricionales (FAN), son sustancias naturales no fibrosas generadas por los mecanismos de defensa a situaciones estresantes o contra el ataque de mohos, bacterias, insectos y aves. Entre los principales FAN, presentes en las leguminosas están los glucósidos cianogénicos, promotores de flatulencia, saponinas, inhibidores de proteasa, estos últimos actuando generalmente sobre la tripsina y la quimotripsina (García 2004). La tripsina es una enzima generada por el páncreas para la digestión de las proteínas, los inhibidores e proteasa inhiben las enzimas proteolíticas al unirse al sitio activo de la enzima, formando un complejo estable. El páncreas segrega  mayor cantidad de enzimas digestivas lo que produce hipertrofia pancreática.

Se ha observado  que la actividad de algunos de estos inhibidores, así como su efecto biológico se reduce al ser sometidos  a procesos fisicoquímicos como: hidratación, cocción, germinación y la combinación de  estos procesos, (Chaparro 2009,  Granito et al., 2009, Hernández y Campos 1993, Bishnoi y Khetarpaul, 1994). Como Objetivos de esta investigación se plantearon: Cuantificar el contenido de antitripsina en leguminosas: Caraota (Phaseolus vulgaris), Quinchoncho (Cajanus cajan ), Tapirama (Phaseolus lunatus ) y Frijol Bayo (Vigna unguiculata). Determinar el efecto que tiene el remojo y la cocción en la cuantificación  e inactivación de los inhibidores de tripsina en leguminosas: caraota (Phaseolus vulgaris ), Quinchoncho (Cajanus cajan ), Tapirama (Phaseolus lunatus ) y Frijol Bayo (Vigna unguiculata).

El consumo de leguminosas ha aumentado en los hogares, en los centros educativos, comedores populares y en todos los centros donde se elaboran dietas alimenticias en Venezuela debido a la creación del Trompo de los Alimentos permitido por el Instituto  Nacional de Nutrición de Venezuela, donde se incluyen como elemento principal las leguminosas conjuntamente con otros alimentos; la manera en que se dispusieron los alimentos en el Trompo tiene como finalidad orientar a la población en la selección adecuada y a una ingesta balanceada de alimentos que conformen su dieta, es decir, aquella que proporciona al organismo todas las sustancias nutritivas que favorecen el crecimiento, desarrollo y buen estado de salud, por lo tanto estar pendiente de los factores antinutricionales y cómo controlarlos fundamenta pertinencia en materia de soberanía y seguridad alimentaria. 

METODOLOGÍA:

En esta investigación de carácter experimental descriptiva, (Arias, 2006), se realizaron muestreos probabilísticos al azar de leguminosas de uso frecuente en los hogares venezolanos: Quinchoncho (Cajanus cajan) de Santa María de la Chapa, parroquia Guzmán Guillermo, municipio Miranda; Tapirama (Phaseolus lunatus) y Frijol bayo (vigna unguiculata) de Pueblo  Nuevo de Paraguaná, municipio Falcón  y Caraota (Phaseolus vulgaris) de Churuguara, municipio Federación, estado Falcón, Venezuela. Adquiriéndose cinco (05) kilogramos de cada leguminosa.

 Muestras crudas de cada leguminosas se molieron y  tamizaron, se tomó un (1) g. de cada muestra y se suspendieron en 19 mL. de agua destilada, se colocaron en agitación durante una (1) hora,   se    ajustó  a pH 7.6, se centrifugaron, se tomó un (1) mL del sobrenadante se diluyó en 50 mL. de solución de  tampón fosfato, Figura 1.

Figura 1. Extractos de leguminosas

Previamente la solución de tampón fosfato se preparó disolviendo 23.3 g. de Na2HPO4.7H2O  y 1.8  g.  De  NaH2PO4.H2O  en 900 mL. de agua, se ajustó el pH a 7.6  y se llevó a un (1) litro el volumen final.

La solución de caseína al 2 %, Se preparó suspendiendo 2 g. de caseína (Bracho y Abdul,(2010), Bracho, (2016) en 80 mL.  de solución de tampón fosfato 0.1 M.  a pH 7.6;  se colocó en un recipiente en baño de María con agua hirviendo por 15 min. con agitación ocasional, hasta la disolución completa de la caseína, se dejó enfriar y se llevó a 100 mL. Con solución de tampón fosfato, Figura 2.

Figura 2. Preparación de solución de caseína   al 2%  a  pH 7.6.

La solución de tripsina se preparó disolviendo 5 mg. de tripsina  SIGMAR  en 100 mL. de HCl  (0.001 M), mantenida en almacenamiento refrigerado.

Los ensayos para determinar la inhibición de la tripsina en leguminosas se realizaron según lo establecido por Kakade et al., (1969), basado en la hidrólisis de la caseína (sustrato) en condiciones de pH y temperatura adecuados, por acción de las proteasas, obteniéndose péptidos de bajo peso molecular no precipitables con ácido tricloroacético y visibles en espectrofotómetro a 365 nm. de longitud de onda.  Se tomaron alícuotas  de 0.2-1.0 mL. de extracto de leguminosa, se pipetearon por duplicado en un conjunto de tubos de ensayo (para cada nivel de extracto), se llevó el volumen de cada tubo a un (1) mL.  Con solución tampón fosfato, los tubos  permanecieron en un baño a 37 °C.

 A cada tubo se adicionó  un (1) mL. de solución de tripsina, y 2 mL. de la solución de caseína (pre-calentada a 37°C). Luego de agregada la solución de caseína,  permaneció la solución exactamente por 20 min., momento en el cual se detuvo  la reacción por la adición de 6 mL. de ácido tricloroacético al 5 %, dicho ácido tiene la propiedad de precipitar  las macromoléculas, (Figura 3). Después de reposar durante una (1) hora a temperatura ambiente, la suspensión se filtró y se midió la transmitancia del filtrado a 365 nm, Bergmeyer (1974), utilizando agua destilada como blanco para posteriormente calcular la absorbancia con la siguiente ecuación.

A=2-log (%T)           

Las unidades de tripsina inhibidas se determinaron por la siguiente ecuación:

UTI= [Abs. muestra-Abs. patron ]x100

El patrón de 100 % actividad de la tripsina se preparó utilizando la misma cantidad de sustrato y enzima y adicionando solución tampón fosfato en vez del extracto de leguminosa.

Figura 3. Ensayo de hidrólisis de la caseína.

Las leguminosas se sometieron a procesos físicos como remojo y cocción para evaluar la estabilidad de los inhibidores de tripsina. Para el remojose tomaron dos (2) muestras de 200 g. de leguminosas, se lavaron y se remojaron durante 8 y 12 horas en agua a temperatura ambiente, en una proporción en volumen de agua-leguminosa de 3:1. Después del remojo los granos se drenaron,  lavaron con agua y se congelaron, luego se secaron, molieron y se preparó el extracto para el análisis.Para la cocciónlas muestras de leguminosa se colocaron en agua en ebullición, el tiempo suficiente (ver Tabla 1), para que las leguminosas alcanzaran una textura granular suave, es decir que estuvieran aptos para ser consumidos como alimento . Las muestras se congelaron, para posteriormente secarse, molerse y analizarse.

Tabla 1.  Tiempo de cocción de las diferentes leguminosas.

Leguminosa Tiempo (min)
Phaseolus vulgaris 120
Phaseolus lunatus 180
Vigna unguiculata 60
Cajanus cajan 120

También se realizó el proceso combinado de remojo-cocción, las muestras se colocaron en remojo durante ocho (8)  horas a temperatura ambiente,  posteriormente se drenaron y se cocieron en agua en ebullición, el tiempo necesario hasta que los granos estuviesen aptos para el consumo (ver Tabla 2). De la misma manera se congelaron para luego ser analizadas.

Tabla  2. Tiempo de cocción de las leguminosas previo remojo.

 Leguminosa Tiempo (min)
Phaseolus vulgaris 70
Phaseolus lunatus 120
Vigna unguiculata 35
Cajanus cajan 75

RESULTADOS Y DISCUSIÓN:

En el presente estudio se determinó el contenido de los inhibidores de tripsina (antinutriente) presente en leguminosas, el cual dificulta la asimilación y digestión de las proteínas. Al evaluar la actividad del inhibidor de tripsina en diferentes extractos de leguminosas,  se obtuvo una  inhibición de 24.73, 13.24, 27.55 y 43.40 Unidades de Tripsina Inhibidas (UTI) para extractos de muestras crudas de Phaseolus vulgaris, Phaseolus lunatus, Cajanus cajan y Vigna unguiculata, respectivamente (Tabla 3), estos valores se pueden clasificar de bajos a moderados ya que en la soya se pueden encontrar hasta 100 UTI, según lo reportado por  Serratos et al.,  2008. Al comparar los valores obtenidos para Phaseolus vulgaris y Phaseolus lunatus, con los reportados por Levi et al., en 1985, se encontró que para  Phaseolus vulgaris los valores son muy semejantes (21 UTI), no siendo igual para Phaseolus lunatus, que presenta un mayor contenido de inhibidores de tripsina (64 UTI).

 De la misma manera que para  Canajus cajan y Vigna unguiculata existe diferencia de acuerdo con lo   reportado por León et al.,  en 1993, dando 18.75 UTI  para Canajus cajan  y 12.50 UTI para Vigna unguiculata. Estas diferencias se justifican de acuerdo a lo citado por García, (2004), quién señaló que los  niveles de estas sustancias antinutritivas como inhibidores de tripsina han presentado variaciones con: la parte de la planta, la especie, el cultivo, la variedad, las condiciones de crecimiento, las estaciones del año y el tratamiento postcosecha (secado, lavado y pasado por autoclave).

Tabla 3. Unidades de Tripsina Inhibidas en muestras de leguminosas crudas.

Leguminosa UTI/mL de extracto de leguminosa
Phaseolus vulgaris 24.73
  Phaseolus lunatus 13.24
Cajanus cajan 27.55
Vigna unguiculata 43.40

Se evaluó la  estabilidad y  posible disminución de los inhibidores de tripsina, para lo cual  las leguminosas fueron sometidas a procesos físicos como remojo y cocción; con el tratamiento de remojo en agua potable por 12 horas se obtuvo una disminución de las UTI de 20.22 % para Phaseolus vulgaris, 40.28 % para Phaseolus lunatus, 13.15 % para Cajanus cajan y 15.07 % para Vigna unguiculata. Estos resultados difieren a lo reportado por Hernández y Campos (1993), quienes indicaron que el remojo no tiene efecto sobre los inhibidores de tripsina.

 Esta disminución puede estar asociada a lo indicado por  Chaparro (2009) y  Granito et al ., (2009), quiénes atribuyeron la pérdida de los inhibidores de tripsina durante el remojo (hidratación), al cambio del gradiente de concentración que varía la tasa de difusión; debido a que los  inhibidores de tripsina son proteínas  de bajo peso molecular por lo que pasan fácilmente de la semilla al medio de hidratación (Bishnoi y Khetarpaul, 1994).

Tabla 4 Porcentajes de disminución de las Unidades de Tripsina Inhibidas, por los diferentes procesos físicos.

                   Proceso físico     Leguminosas Remojo 12 horas (%) Remojo por 8 horas y secado a 120°C    (%) Cocción (%) Remojo y cocción (%)
Phaseolus vulgaris 20.22 34.45 88.86 91.78
Phaseolus lunatus 40.28 44.74 79.34 80.98
Cajanus cajan 13.15 35.15 88.08 91.71
Vigna unguiculata 15.07 62.49 90.49 91.29

El remojo por 8 horas resultó más efectivo en la disminución de los inhibidores de tripsina al compararlo con el remojo por 12 horas, debido a que el secado de las muestras de leguminosas se realizó en la estufa a 120 °C (por 4 horas) a diferencia del tratamiento de remojo por 12 horas y secado a una temperatura inferior a 50 °C, este tratamiento térmico adicional presentó  mayor disminución, debido,  posiblemente a una desnaturalización térmica del antinutriente.

 El proceso térmico (cocción) aplicado a las muestras de leguminosas, resultó ser un método físico eficaz en la disminución de las UTI, como se muestra en la Tabla 11, se obtuvo una reducción de 88.86 % para Phaseolus vulgaris, 79.34 % para Phaseolus lunatus, 88.08 % para Cajanus cajan y  90.49 % para Vigna unguiculata, quedando evidenciado la naturaleza termolábil de la antitripsina como factor antinutricional  (Belmar, 2000). Al  comparar estos resultados con  los obtenidos por Benites et al.,  (2008) y Elizalde et al., (2009),  se logró una reducción de la actividad antitripsinica en Phaseolus vulgaris de 73 % con la cocción de la  leguminosa.

Se  evaluó el efecto que produce la combinación de tratamientos físicos en la disminución de las UTI, las muestras de leguminosas fueron sometidas a hidratación por 8 horas y posterior cocción; se obtuvo  un mínimo aumento en la disminución de la UTI,  al compararla con el proceso de cocción (sin remojo),  (ver Tabla 4); cabe mencionar que el remojo suaviza el grano y disminuye el tiempo de cocción.

El resultado del efecto de estos tratamientos físicos en la disminución de los inhibidores de tripsina se muestra de manera resumida en la Figura 4.

Figura 4. Comparación de los procesos físicos en la disminución de las unidades de tripsina inhibidas

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES:

La Caraota, Frijol bayo, Tapirama y Quinchoncho, contienen factores antinutricionales como la antitripsina, obteniéndose valores de 24.73, 43.40, 13.24 y 27.55 UTI, respectivamente. Estos valores se pueden clasificar de bajos a moderados en comparación con la Soya.

El proceso de hidratación reduce en promedio el 22 % de los niveles de antinutrientes de las leguminosas, debido a la solubilidad que presentan estas proteínas (antitripsina) de bajo peso molecular. Cuando la hidratación se combina con procesos térmicos como el secado en estufa a 120 °C la disminución alcanza en promedio el 44 %.

Los tratamientos térmicos como cocción y la hidratación seguida de la cocción, fueron los métodos más efectivos en la disminución de los inhibidores de tripsina (en promedio 86.7 % y 88.9 %, respectivamente) debido a la naturaleza termolábil de este factor antinutricional. La hidratación, seguida de la cocción, suaviza el grano y permite que esta sea posible en menor tiempo, la combinación de tratamientos  físicos facilita el proceso de disminución de la actividad antitripsinica.

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